《Þróun skáldsögu CAS13A/CAS12A-miðluð„Einn pottur“ tvískiptur Greiningargreining á erfðabreyttri ræktun.
Erfðabreytt ræktun hefur verið gróðursett víða um allan heim og mörg lönd hafa smám saman bætt reglugerðarráðstafanir sínar til að tryggja öryggi erfðabreyttra ræktunar. Þróun skjótra og nákvæmra erfðaaðferða á staðnum er mjög mikilvæg fyrir landbúnað og lífríki og getur dregið úr áhyggjum almennings vegna erfðabreyttra afurða.
Í þessari rannsókn þróaði rannsóknarhópurinn nýjan einn pottviðbrögð -- mira tvískiptur uppgötvun ásamt tvöföldum CRISPR (MR-DCA aðferð) til samtímis uppgötvunar CAMV35s og NOS erfða markmið í erfðabreyttri ræktun, sem veitir einfalda og skilvirka uppgötvunaraðferð til að greina erfðafræðilega ræktun.
Tilraunaaðferðir
Mira tvískiptur afurðin er greind með Cas13a og Cas12a tvöföldu kerfi til að búa til tvö sjálfstæð merki sem trufla ekki hvort annað, og þá er flúrperu liturinn lesinn með lýsingartæki eða með prófunarrönd með tveimur T línum til að ná tvöföldum rásarlestri. Allt ferlið er lokið á innan við 35 mínútum, með greiningarmörk allt að 20 eintökum.
(Meginregla MR-DCA uppgötvun CAMV35s og NOS)
Öllum tilrauninni er skipt í þrjú skref: mira mögnun, CRISPR viðbrögð og tvær aðferðir við túlkun niðurstaðna.
CAMV35S genið er notað sem markmið Cas13a og NOS genið er notað sem markmið Cas12a. Tvö pör af mira grunnur voru hönnuð í sömu röð. CAS13A kerfið þekkir aðeins RNA, þannig að framsóknarsvæðið er hannað, sem inniheldur T7 verkefnisstjóra fyrir síðari umritun og virkjun CAS13A. PAM er bætt við NOS genið. Ofangreindar viðbætur tryggja að bæði Cas13a og Cas12a prótein geti bundist við crrnas sín og engin truflun eða krossviðbrögð eru á milli kerfanna tveggja.
Tilraunaástand
Næmi og sértæki
Sýnið var þynnt í halla til að prófa flúrljómunarstyrk mira viðbragða. Í ljós kom að enn var hægt að greina flúrljómunarstyrkinn við sýni styrk 20 μl. Styrkur 20 μl var loksins valinn fyrir tilraunina.
(Mismunandi styrkur sýnisins og prófstrimlar eru notaðir við litþróun og útreikning á styrkleika styrkleika)
Til að meta enn frekar sérstöðu MR-DCA prófaði rannsóknarteymið blandað sýni af dýrum sem ekki voru transgenísk og ekki transgenískar plöntur. Niðurstöðurnar sýndu að aðeins erfðabreytt sýni sem innihéldu CAMV35 og NOS voru með mikla flúrljómunarmerki, en flúrljómunarstyrkur annarra sýna var nálægt því sem var neikvæða stjórnunarinnar. Hægt er að nota MR-DCA sem sértækan tvöfaldan-miða kjarnsýrugreiningarvettvang.
24 uppskerusýni voru prófuð af MR-DCA. Meðal þeirra, 1, 2, 15, 16, 21 og 22, eru erfðabreytt korn sem inniheldur CAMV35S verkefnisstjóra. 7, 8, 23 og 24 eru sjúkdómsþolnar erfðabreytt hrísgrjón sem innihalda NOS Terminator. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 og 18 eru erfðabreyttar sojabaunir sem innihalda CAMV35S verkefnisstjóra og NOS Terminator.
(Niðurstöður prófa 24 sýni)
Hröð viðbrögð
Viðbragðstími er mikilvægur þáttur í uppgötvun á staðnum. Rannsóknarteymið tók fram að hægt væri að greina flúrljómunamerki FAM og HEX með flúrljómunartæki þegar viðbragðstíminn var 10 mínútur. Mira ásamt CRISPR viðbrögðum sá einnig fyrir gulum flúrljómun eftir 15 mínútur.
(Flúrljómunarmerki á mismunandi mira viðbragðstímum)
(Litþróun prófstrimla á mismunandi mira viðbragðstíma og útreikningi á styrkleika)
Tilraunaniðurstaða
Niðurstöður tilrauna sýndu að tvískiptur mira hefur góða sérstöðu og getur nákvæmlega fengið magnunarafurðir CAMV35s og NOS. CAS13A og CAS12A kerfin bregðast sjálfstætt við án þess að trufla hvert annað. MR-DCA prófið getur greint nákvæmlega 20 eintök við lágan hita í 35 mínútur, sem hefur mikið gildi til að greina erfðabreyttan ræktun á sviði.
Upplýsingar um grein
Nafn dagbókar: 《Journal of Advanced Research Express
Titill greinar: 《Þróun skáldsögu CAS13A/CAS12A-miðluð „einn-pott“ tvískiptur greiningargreining fyrir erfðabreyttan ræktun.
Áhrif þáttur: 11.4
Rannsóknarteymi: Wang Xiaofu, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences