Grasrækjur eru mikilvægar efnahagslegar tegundir í fiskeldisiðnaði í Kína. Undanfarin ár, hins vegarLifrarporidium í lifur(EHP), sníkjudýr sem smitar lifrarvexti rækju, hefur haft veruleg áhrif á iðnaðinn. Þar sem nú er ekkert áhrifaríkt lyf eða bóluefni til að meðhöndla þennan sjúkdóm er hröð og nákvæm uppgötvun lykilatriði til að koma í veg fyrir útbreiðslu hans.
A.magnified 9. 0 × 1 0 3 sinnum; B. Stækkað 5,0 × 104 sinnum.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang GE, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Einangrun og formfræðileg athugun á lifrarfræðilegri microsporidium í litopenaeus vannamei. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Greining á EHP byggir fyrst og fremst á sameindalíffræðiaðferðir, þar sem PCR tækni er algengust. En þó að PCR bjóði upp á mikla næmi, þá þarf það dýran PCR búnað og sérhæfð rannsóknarstofuumhverfi, sem gerir það óhentugt til notkunar á sviði. Til að takast á við þetta mál þróaði rannsóknarteymið tvær skjótar uppgötvunaraðferðir byggðar á Mira tækni. Þessar aðferðir bjóða upp á mikla næmi, skjót viðbrögð og auðvelda notkun, sem gerir kleift að gera skilvirka og skjótan uppgötvun EHP í rækju á staðnum án þess að þurfa flókinn rannsóknarstofubúnað og fylla þannig bilið í núverandi uppgötvunaraðferðum.
Mögnun hvarfefna sem notuð voru í rannsókninni:
- DNA isothermal Rapid Amplification Kit (BASIC)
- DNA isothermal Rapid Amplification Kit (Colloidal Gold Strip Type)
Mira tækni er fjölensím isothermal hröð kjarnsýru mögnun aðferð. Meginregla þess felur í sér samhæfða verkun margra virkra próteina við umhverfishita til að ná skjótum kjarnsýru mögnun, sem gerir kleift að vera raunverulega flytjanlegur, á staðnum kjarnsýrugreining.
Rannsóknaraðferðir
Sýnishorn útdráttur
Rannsóknarteymið safnaði bæði smituðum og heilbrigðum grasrækjum úr þremur rækjubúum í Liaoning -héraði og náðu DNA úr lifrarprófi rækju.
Grunnhönnun
Þrjú sett af Mira grunnur voru hannaðir sem miða við S8 serínprótein gen EHP (GenBank aðildarnúmer: Árið 182063). Þetta gen hefur einstaka virka staði og tryggir sérstöðu uppgötvunar.
Mira-Age og Mira-LFD uppgötvun
(A) Hitastig RPA-aldurs viðbragðshitastigs. M: DL 500 merki; N: Neikvæð stjórn; Stofnar 1-5: 25 gráðu, 30 gráðu, 37 gráðu, 39 gráðu og 42 gráðu.
(B) Bjartsýni viðbragðstíma RPA-aldurs. M: DL 500 merki; N: Neikvæð stjórn; 1: 10 mín; 2: 20 mín; 3: 30 mín; 4: 40 mín.
(C) Bjartsýni RPA-LFD viðbragðshitastig. N: Neikvæð stjórn; 1: 25 gráðu; 2: 30 gráðu; 3: 37 gráðu; 4: 39 gráðu; 5: 42 gráðu.
(D) Bjartsýni RPA-LFD viðbragðstíma. N: Neikvæð stjórn; 1: 5 mín; 2: 10 mín; 3: 20 mín.
Þessar tvær Mira uppgötvunaraðferðir, Mira-Age (agarósa hlaup rafskaut) og mira-lfd (kolloidal gull hliðarflæði ónæmisgreining), voru notaðar til að greina EHP. Rannsóknarteymið fínstillti viðbragðshitastig og tíma með tilraunum. Mira-aldur magnaði mark DNA á 30 mínútum við 37 gráðu en Mira-LFD lauk mögnun á aðeins 10 mínútum við 37 gráðu, með niðurstöður læsilegar innan 5 mínútna.
Niðurstöður tilrauna
Sértæki og næmi
(A) Sértækni uppgötvunar á RPA-aldri. M: DL 1000 merki; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: heilabólga; 3: Microsporidia; 4: White Spot heilkenni vírus; 6: Óeðlilegt; N: Neikvæð stjórn.
(B) Sértækni RPA-LFD uppgötvunar. P: Nosema Bombycis; N: Neikvæð stjórn; 1: EHP; 2: heilabólga; 3: Microsporidia; 4: White Spot heilkenni vírus; 6: Óeðlilegt.
(C) Næmi RPA-aldurs með halla þynningar á raðbrigða plasmíðum. M: DL 500 merki; N: Neikvæð stjórn; 1: 4,7 × 10^5 eintök/µl; 2: 4,7 × 10^4 eintök/µl; 3: 4,7 × 10^3 eintök/µl; 4: 4,7 × 10^2 eintök/µl; 5: 4,7 eintök/µl; 6: 4,7 eintök/µl.
(D) Næmi RPA-LFD með halla þynningar á raðbrigða plasmíðum. N: Neikvæð stjórn; 1: 4,7 × 10^5 eintök/µl; 2: 4,7 × 10^4 eintök/µl; 3: 4,7 × 10^3 eintök/µl; 4: 4,7 × 10^2 eintök/µl; 5: 4,7 eintök/µl; og 6: 4,7 eintök/µl.
Tilraunirnar sýndu fram á að Mira tækni hefur mikla sérstöðu og greinir nákvæmlega EHP án þess að bregðast við öðrum sýkla. Hvað varðar næmi höfðu báðar aðferðirnar greiningarmörk 4,7 eintök/µL, marktækt hærri en næmi hefðbundins PCR.
Klínísk sýnispróf
Niðurstöður úr því að prófa 30 klínísk sýni sýndu að Mira-Age og Mira-LFD voru með jákvæðni 70%, aðeins lægri en 80%QPCR en verulega hærri en 56,7%PCR.
Horfur umsóknar
Greiningaraðferðir sem byggðar eru á Mira gera kleift að magna miða gen við stöðugt hitastig. Sérstaklega getur Mira-LFD aðferðin skilað árangri á aðeins 10 mínútum án þess að þurfa flókinn rannsóknarstofubúnað, sem gerir það tilvalið til notkunar á staðnum í rækjubúum. Mikil næmi og sértæki þessarar tækni gerir það að skilvirku tæki til að uppgötva snemma og stjórna EHP og vernda þar með heilsu og þróun grasræktaræktariðnaðar.
Meðal þessara aðferða er kolloidal gull hliðarflæði ónæmisgreining (Mira-LFD) sérstaklega vel til notkunar á staðnum vegna einfaldleika þess og leiðandi niðurstaðna. Grasrækjubændur geta greint og brugðist við EHP sýkingum fljótt, bætt getu sjúkdómseftirlits, aukið verulega hagkvæmni í búskapnum og dregið úr efnahagslegu tapi.