Sýnileg og hröð uppgötvun katta-chaphamaparvoveiru með því að nota fjölensím ísóvarma hraða mögnun og hliðarflæðismælingu
Tímarit:Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
Áhrifaþáttur:4.6
Katta chaphamaparvoveira(FeChPV)er ný parvóveira, sem fyrst greindist í niðurgangsköttum í Kanada árið 2019. Meinvirkni hennar og sameindaeiginleikar eru enn óljós og hún sýnir hýsils og erfðafræðilegan fjölbreytileika, sem krefst frekari faraldsfræðilegrar rannsóknar. Eins og er, er engin staðlað aðferð til að greina FeChPV.
Multienzyme isothermal rapid amplification-lateral flow dipstick (MIRA-LFD) aðferðinhefur verið notað með góðum árangri til að greina ýmsa vírusa, sem býður upp á kosti eins og hraða, einfaldleika og engin þörf á nákvæmnistækjum. Rannsóknarteymið kom á MIRA-LFD aðferð sem hentar FeChPV til að takast á við áskoranir í klínískri greiningu grasrótar. Án þess að treysta á nákvæmnistæki,MIRA-LFD aðferðin lauk FeChPV greiningu við 37 gráður innan 20 mínútna og sýndi enga kross-viðbrögð við öðrum vírusum. Greiningarmörkin voru 32,3 eintök/μL,10 sinnum hærri en PCR aðferðin. Ennfremur greindi MIRA-LFD aðferðin 29 FeChPV-jákvæð sýni meðal 417 katta með niðurgang, með jákvæðni hlutfalli aðeins hærra en í hreiðri PCR aðferðinni. Þessar niðurstöður benda til þess að hin þekkta MIRA-LFD aðferð til að greina FeChPV sé skilvirk, hagkvæm, áreiðanleg og einföld aðferð, sem stuðlar að því að koma í veg fyrir og stjórna FeChPV sýkingu snemma.
1.Tilraunaaðferðir
Klínísk sýni:Sýnum úr endaþarmsþurrku, sem notuð voru í þessari rannsókn, var safnað úr 632 köttum (þar af 417 með niðurgang og 115 heilbrigðum köttum) og 474 hundum (þar af 342 með niðurgang og 132 heilbrigðum hundum) á dýralæknastofum í Guangdong, Henan, sjálfstjórnarhéraðinu, Anhui-héraði, Zhongshan, 2022 og 2024.
Kjarnsýrumögnun:Útdregin DNA kjarnsýru var bætt við MIRA kerfið. Recombinasi og primers mynduðu flókið; með hjálp hjálparpróteina og einstrengja bindandi próteina réðust þeir inn í tvíþátta DNA sniðmátið. Primers bundust samhljóða fyllingarsvæðum til að mynda D-lykkjusvæði, á meðan recombinasinn var tekinn í sundur úr fléttunni. Pólýmerasi bundist við 3' enda primeranna og hóf DNA myndun, veldisvísismagnandi marksvæðið á sniðmátinu. Þetta ferli gekk hratt og vel og náði þar með ofur-hröðri mögnun á markhlutanum á aðeins 15 mínútum.
Litaþróun prófunarræma:Kjarnsýrumögnunarafurðin var þynnt 1:10, sett á prófunarstrimlinn og niðurstöður voru lesnar eftir 5 mínútur.
Allt ferlið frá kjarnsýrumögnun til litaþróunar á prófstrimlum tók aðeins 20 mínútur.
Amp-framtíðarlíffræðilegar vörur voru notaðar í tilrauninni:
Í rannsókninni voru fjögur hönnuð sett af sértækum grunnrannsókna-rannsóknasamsetningum skimuð. Bæði agarósagel rafdráttur og kjarnsýruprófunarstrimar voru notaðir til að kynna niðurstöðuna. Allar fjórar primer-rannsóknarsamsetningarnar gætu greint FeChPV vírusinn. Samkvæmt niðurstöðum agarósa gel rafdráttar sýndi FeChPV-4 samsetningin bjartasta marksviðið, þannig að þessi samsetning var valin til síðari prófunar.
Samkvæmt niðurstöðum agarósa gel rafdráttar gaf mögnun í 5, 10, 15 og 20 mínútur allt marksviðið. Markbandsstyrkurinn náði hámarki við 15 mínútur af mögnun, og staðfesti 15 mínútur sem ákjósanlegur viðbragðstími fyrir þessa greiningu. Mögnun við 36 gráður, 37 gráður, 38 gráður, 39 gráður og 40 gráður myndaði öll marksviðið, þar sem bjartasta sviðið sást við 39 gráður, sem staðfestir 39 gráður sem ákjósanlegasta hvarfhitastigið fyrir þessa greiningu.
(Mynd A: 1: Mögnun 5 mín; 2: Mögnun 10 mín; 3: Mögnun 15 mín; 4: Mögnun 20 mín) (Mynd B: 1: Mögnun 36 gráður ; 2: Mögnun 37 gráður ; 3: Mögnun 38 gráður ; 3: gráður mögnun ; 4: gráðu mögnun)
2. Uppgötvun árangur
Næmi:
(Mynd A: MIRA niðurstöður kynntar með því að nota agarósa gel rafdrætti)
(Mynd B: Hreiður PCR niðurstöður kynntar með agarósa gel rafdrætti)
(Mynd C: MIRA niðurstöður kynntar með kjarnsýruprófunarstrimlum)
Sýnin voru sett í 10-falda raðþynningu frá 3,23×10⁶ eintökum/μL. Hreiður PCR með agarósa gel rafdrætti gæti greint stöðugt 3,23×10² eintök/μL; MIRA með agarósa gel rafdrætti og MIRA með kjarnsýruprófunarstrimlum gátu bæði greint stöðugt 3,23×10¹ eintök/μL.
MIRA aðferðin sýndi stöðugt næmni með því að nota tvö mismunandi snið til kynningar á niðurstöðum og næmi MIRA aðferðarinnar var meira en hreiðrað PCR.
Sérhæfni:
(1: FeChPV, katta-chaphamaparvoveira; 2: FPV, katta-húðafæðaveira; 3: FeAstV, kattastróveira; 4: FBoV, katta-bocaveira; 5: CachaV, hunda-chaparvoveira; 6: neikvæð stjórn)
Nýstofnaða MIRA-LFD aðferðin greindi aðeins FeChPV og sýndi enga kross-viðbrögð við öðrum viðmiðunarvírusum, sem gefur til kynna góða sértækni.
3. Rannsóknarsamantekt
Þessi rannsókn kom á MIRA-LFD aðferð til að greina FeChPV án þess að þörf væri á mikilli-nákvæmni tækjum. Sem skilvirk, hagkvæm og áreiðanleg greiningaraðferð með mikla næmni og sérhæfni, er MIRA-LFD aðferðin hentugri fyrir klíníska uppgötvun og veitir tæknilega aðstoð til að koma í veg fyrir og stjórna FeChPV sýkingu snemma.
4.AMP-FRAMTÍÐARLIFTÆKNI
MIRA fjölensím jafnhita hröð kjarnsýrumögnun er tækni sem sannarlega gerir -hraða greiningu á staðnum kleift.
MIRA tæknin byggir á endurröðunarviðgerðarkerfi gena in vivo, sem byggir á samverkandi verkun margra virkra próteina við stofuhita til að ná hraðri (5-20 mín), viðkvæmri, sértækri og öruggri kjarnsýrumögnun við stofuhita (25 gráður –45 gráður). Vegna jafnhita eðlis MIRA tækninnar hefur hún litlar kröfur um búnað og einfalda notkun. Með smækkuðum, flytjanlegum tækjum er hægt að beita því í fremstu víglínuprófunum á ýmsum notkunarsviðum, sem færir hraðvirkar og nákvæmar kjarnsýruprófanir í stillingar eins og POCT, heimaprófanir, landbúnaðarsvið og-löggæslu á staðnum. Byggt á MIRA tækni, hefur Amp-future Biotech þróað röð af-hraðprófunarvörum á staðnum, þar á meðal hraðlosunarefni fyrir kjarnsýrur, jafnhita hraða kjarnsýrumögnunarhvarfefni, kvoðaprófunarræmur úr gulli og litlum flytjanlegum búnaði, sem skapar heildarlausn fyrir-hraða sameindaprófanir á staðnum. Ennfremur býður MIRA tækni Amp-future upp á notkunarkosti þegar hún er sameinuð CRISPR tækni, NGS, SNP, örvökva og fleira.
Til viðbótar við röðina af-hraðprófunarvörum sem sýndar eru hér að ofan, býður Amp-future Biotech einnig upp á:
Rannsóknarhvarfefni:Að veita hvarfefnishráefni og tæknilega aðstoð við grunnvísindarannsóknir, svo og tilvísanir í verkefnabókmenntir.
OEM framleiðsla:Geta sjálfstætt framleitt há-hreinar,-virkni fullunnar vörur í öllu ferlinu, og ná fram framleiðslu í iðnaðar-mælikvarða.
Verkefnaþróun:Raðupplýsingar og niðurstöður úr röðunargreiningu, verkefnisgrunnur-rannsóknarhönnun og myndun, plasmíðgerð verkefnis og sýni, verkefnisskýrslur og niðurstöður o.s.frv.
Fyrir frekari upplýsingar, velkomið að spyrjast fyrir.